在生命科学实验中，抗体作为核心工具，其应用的每个环节都可能成为数据偏差的源头。从抗体选型时的种属错配，到实验操作中的洗板疏漏，再到结果分析时的异常排查，科研人员常面临诸多挑战。

三大关键步骤:

1. 封闭液：针对目标蛋白的 “精准屏蔽”

检测糖基化蛋白时使用脱脂奶粉封闭，结果 WB 出现杂带 —— 脱脂奶粉中的糖基化杂质与抗体发生交叉反应。

✅ 差异化选择：

普通蛋白：5% 脱脂奶粉（室温封闭 1 小时，经济高效）

修饰化蛋白（磷酸化 / 糖基化）：1% 无修饰 BSA（纯度≥99%，减少杂质干扰）

组织样本：10% 与一抗宿主同源的血清（如兔抗用山羊血清，降低种属间 Fc 受体结合）

进阶技巧：封闭时轻轻摇晃容器，确保膜 / 板均匀覆盖，避免局部未封闭区域

2. 洗涤：“细节控” 的必胜法则

ELISA 洗板时少洗 1 次，背景值升高 20%—— 残留抗体导致非特异性信号积累。

✅ 标准化操作：

ELISA 洗板：每孔加入 300μL 洗涤液（含 0.1% Tween-20 的 PBS），浸泡 30 秒后垂直甩干，重复 5 次以上，最后用吸水纸轻拍板底（避免残留液影响读数）

WB 洗膜：使用 TBST 洗涤时，将膜放入培养皿，加入 10mL 洗涤液，缓慢摇荡（150rpm），每次 5 分钟，洗 3 次，确保膜完全浸没，避免干燥（干燥会增加非特异性结合）

3. 孵育：温度与时间的 “黄金组合”

检测细胞核蛋白时 4℃过夜孵育，结果背景过高 —— 低温延长非特异性结合时间。

✅ 动态调整策略：

一抗孵育：

高表达蛋白（如内参 GAPDH）：室温 1 小时（快速结合，减少背景积累）

低表达 / 易降解蛋白（如转录因子）：4℃过夜（低温稳定蛋白构象，提高结合效率）

二抗孵育：荧光二抗必须避光！可在孵育盒内放置避光纸，室温 1 小时足够（过长易导致荧光淬灭或非特异性吸附）