空白值(OD值)是直接反映洗涤效果的关键指标。若空白孔吸光度超过0.2(或试剂盒规定阈值)，通常提示洗涤不彻底，残留的非特异性结合物导致背景信号增高。

操作要点

‌标准要求‌：空白孔OD值应低于0.2，且复孔间差异需小于20%。

‌异常处理‌：若空白值偏高，需检查：

洗涤次数是否足够(建议3-5次)；

洗涤液是否新鲜配制，洗板机针头是否堵塞；

是否充分拍干孔内残留液体。

优化建议

增加洗涤次数至5次，每次浸泡1分钟；

在洗涤液中添加0.05% Tween-20以减少非特异性吸附；

使用自动洗板机时，确保注液量(300μL/孔)和抽吸彻底。

通过严格控制空白值并优化洗涤流程，可有效提升ELISA检测的准确性。

深入优化策略与常见问题解析

1. 高背景值溯源

- 试剂因素：检查酶标二抗是否过量(建议稀释梯度测试)，显色底物避光保存是否规范。若使用HRP系统，需注意实验用水TMB值需＜0.01。

- 板间差异：同一批次板条建议预实验筛选边缘效应，孵育时采用湿盒密封避免蒸发不均。

2. 自动化设备校准

- 洗板机维护周期应≤3个月，重点检查：

- 注液高度(液柱需覆盖孔底2/3)

- 残留量(抽吸后孔内液体≤5μL)

- 建议每月用亚甲基蓝溶液进行管路通畅性测试

3. 特殊样本处理

对于血清/血浆样本：

- 增加1% BSA封闭步骤(37℃ 30min)

- 离心后取中层清液，避免脂质干扰

- 高溶血样本建议用0.22μm滤膜预处理