实验报告：

一、MLTC-1(睾丸间质细胞瘤细胞) 分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

ZNF154 ELISA KitRat Mbp(Myelin basic protein) ELISA Kit十八烷基三甲氧基硅烷血液组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试剂盒

ZKSCAN1 ELISA KitRat Tpo(Thyoid Peroxidase) ELISA Kit邻二甲苯体液组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试剂盒

ZC3HC1 ELISA KitRat S100B(S100 Calcium Binding Protein B) ELISA Kit邻二甲苯细胞组织蛋白酶D（CATHEPSIN D）活性荧光定量检测试剂盒

ZCCHC11 ELISA KitRat Cartpt(Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein) ELISA Kit邻二甲苯组织样品组织蛋白酶D（CATHEPSIN D）活性荧光定量检测试剂盒

ZFP36L2 ELISA KitRat PICP(C-terminal propeptide of Collagen alpha-1(I)chain) ELISA Kit邻二甲苯细胞组织蛋白酶H（CATHEPSIN H）活性荧光定量检测试剂盒

ZFP64 ELISA KitRat Col2a1(Collagen alpha-1(II)chain) ELISA KitO-(四氢吡喃-2-基)羟胺组织样品组织蛋白酶H（CATHEPSIN H）活性荧光定量检测试剂盒

ZNF703 ELISA KitRat PIIINP(N-terminal propeptide of Collagen alpha-1(III)chain) ELISA KitO-(四氢吡喃-2-基)羟胺细胞组织蛋白酶S（CATHEPSIN S）活性荧光定量检测试剂盒

MCPIP(Monocyte Chemoattractant Protein-induced Protein 1) ELISA KitRat AQP-4(Aquaporin-4) ELISA Kit2-甲基苯硼酸组织样品组织蛋白酶S（CATHEPSIN S）活性荧光定量检测试剂盒

NNT ELISA KitPARP3  多腺苷二磷酸多聚酶3抗体/多聚ADP-核糖聚合酶3二水氧化三甲胺苄啶进口/国产Cystatin E/M  半胱氨酸蛋白酶抑制剂6抗体含量：HPLC法含量测定用

NPAS1 ELISA KitPARP4  多腺苷二磷酸多聚酶4抗体/多聚ADP-核糖聚合酶4三苯基膦三间磺酸三钠盐己酸羟孕进口/国产CRABP2  细胞维酸结合蛋白2抗体含量：含量测定

NNT ELISA KitDOCK1  细胞质分裂付出蛋白1抗体三苯基膦三间磺酸三钠盐己雌酚进口/国产CST7/Cystatin F  半胱氨酸蛋白酶抑制剂7抗体含量：含量测定

NMUR1 ELISA KitEDA2R/TNFRSF27  肿瘤坏死因子受体超家族成员27抗体四氢-吡喃-4-酮枸橼酸米芬进口/国产NBL1/DAND1  神经母细胞瘤抑瘤蛋白1抗体含量：含量测定

NOXA2/p67phox ELISA KitEDG1/CD363/S1P1  内皮细胞分化鞘脂G蛋白偶联受体1抗体四氢-吡喃-4-酮磺酸双氢麦角进口/国产DLL4/Delta 4  Notch信号通路Delta样配体4抗体含量：含量测定

NPAS1 ELISA KitFEM 1B  FEM1B抗体3,3'-硫代二丙酸克唑进口/国产DPP2  溶酶体丝氨酸蛋白酶DPP2抗体含量：HPLC法含量测定

NO66/C14orf169 ELISA KitAIF  调亡诱导因子抗体3,3'-硫代二丙酸邻磺酰进口/国产FSTL1/FRP  卵泡相关蛋白1含量：检查

NPAS3 ELISA KitBACH1/BRIP1  乳腺癌易感基因相互作用蛋白1抗体3,3',5,5'-四甲基联苯胺6-巯呤进口/国产HPGD/PGDH1/Prostaglandin dehydrogenase 1  前列脱氢酶1抗体含量：检查

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。