‌CCK8法检测P6代细胞增殖的核心步骤‌包括铺板、给药处理、显色检测与数据分析，需严格控制细胞状态和操作一致性以确保结果准确。

一、实验前准备

‌细胞复苏与培养‌：将P6代细胞复苏后接种于培养瓶中，使用适宜培养基(如DMEM+10% FBS)在37℃、5% CO₂培养箱中培养至对数生长期。

‌细胞计数与调整浓度‌：用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，通过血球计数板或自动细胞计数器测定细胞密度，并调整至合适范围(建议3000–7000个/孔，具体根据细胞大小和增殖速度优化)。

二、铺板与预培养

‌接种细胞‌：将细胞悬液以每孔100 μL加入96孔板，每组设置3–5个复孔，避免边缘效应可在外圈孔加PBS或培养基。

‌预培养‌：将96孔板放入37℃、5% CO₂培养箱中培养12–24小时，使细胞充分贴壁并恢复状态。

三、药物处理(如需)

若检测药物对P6代细胞增殖的影响，吸除旧培养基，加入含不同浓度药物的新鲜培养基，继续孵育6–72小时(根据实验设计选择时间点)。

四、CCK8显色检测

‌加入CCK8试剂‌：每孔加入10 μL CCK8溶液(终体积约10%)，轻轻震荡混匀，注意避免产生气泡。

‌避光孵育‌：将96孔板放回培养箱中避光孵育1–4小时(建议每半小时测一次OD值，当吸光度在1.0–2.0之间时停止)。

‌测定吸光度‌：使用酶标仪在450 nm波长下读取各孔OD值，若有背景干扰可设置630 nm为参比波长进行校正。